Det er nu muligt at opnå tredimensionelle billeder i høj opløsning af enzymaktivitet i vævsprøver eller hele organer-takket være molekyler, der anker fluorescerende farvestoffer inden for væv, når de aktiveres af enzymer. Det organ, der kortlægges, bliver gennemsigtigt af en clearingproces.
Som et japansk team rapporterede i tidsskriftet Angewandte Chemie International Editiondette muliggjorde visualisering af forskelle i aminopeptidase N -aktivitet og virkningerne af hæmmere i musens nyrer.
Enzymer spiller en afgørende rolle i reguleringen af fysiologiske funktioner, og unormal enzymaktivitet er relateret til en række patologiske tilstande. Enzymaktivitet varierer fra organ til organ såvel som inden for forskellige regioner i et enkelt organ. Det ville således være informativt at opnå præcis billeddannelse af enzymaktivitet i væv med detaljeret rumlig opløsning. Desværre mangler passende teknikker.
Billeddannelse af enzymaktivitet udføres hovedsageligt med fluorescensprober. Imidlertid trænger lysstofrør næppe ind i væv, så større prøver som hele organer kan ikke kortlægges i 3D. En proces, der kaldes clearing, kunne hjælpe med dette. Clearing er en traditionel proces, hvorved vævsprøver udføres meget gennemsigtige med forskellige opløsningsmidler og reagenser, mens de opretholder deres struktur. Under den intensive vask bliver små molekyler som fluorescerende sonder imidlertid også vasket ud af vævet.
Et team ledet af Shinsuke Sando på University of Tokyo har nu udviklet en ny metode til billeddannelse af aktiviteten af et enzym i 3D i høj opløsning inden for hele, ryddet organer. Som et eksempel valgte de aminopeptidase N (APN), et peptid-splittende enzym, der spiller en vigtig rolle i forskellige fysiologiske processer såvel som udviklingen af tumorer. Deres succes skyldtes et specielt udviklet sonde -molekyle, der består af et fluorescerende farvestof (Bodipy), en “forankringsenhed” og en aminosyregruppe (alanin).
Hvis der ikke er nogen aktiv APN til stede, forbliver sonden uændret og skylles ud under vævsrensningsprocessen. I regioner i organet med aktiv APN opdeler enzymet aminosyregruppen fra sonden og aktiverer forankringsenheden. Dette fastgøres til proteiner i nærområdet og forankrer solidt den fluorescerende sonde til den omgivende vævsstruktur, så den ikke vaskes væk.
Dette gjorde det muligt for teamet at opnå 3D-kort med høj opløsning af APN-aktivitet med fluorescensmikroskopi i hele musens nyrer. Forskerne var endda i stand til at visualisere forskelle i APN -aktivitet i individuelle rørformede strukturer i nyrerne.
Holdet studerede også virkningerne af APN -hæmmere. De observerede forskellige mønstre i undertrykkelse af fluorescens mellem det eksperimentelle antitumormiddel actinonin og en anden APN -hæmmer. Disse forskelle kan være resultatet af forskelle i absorption, stofskifte og/eller farmakokinetik.
Den nye billeddannelsesteknologi åbner vejen for en objektiv evalueringsmetode til lægemiddeludvikling, der ikke overser små fænomener, der forekommer på cellulær niveau i hele organer.