Tuberkulose, verdens dødeligste infektionssygdom, anslås at inficere omkring 10 millioner mennesker hvert år og dræber mere end 1 million årligt. Når de er etableret i lungerne, hjælper bakteriens tykke cellevæg med at bekæmpe værtsimmunsystemet.
Meget af den cellevæg er lavet af komplekse sukkermolekyler kendt som glycaner, men det er ikke godt forstået, hvordan disse glycaner hjælper med at forsvare bakterierne. En af grundene til det er, at der ikke har været en nem måde at mærke dem inde i celler.
MIT-kemikere har nu overvundet den hindring, hvilket demonstrerer, at de kan mærke en glycan kaldet manlam ved hjælp af et organisk molekyle, der reagerer med specifikke svovlholdige sukkerarter. Disse sukkerarter findes i kun tre bakteriearter, hvoraf den mest berygtede og udbredte er Mycobacterium tuberculosis, den mikrobe, der forårsager TB.
Resultaterne offentliggøres i tidsskriftet Forløb af National Academy of Sciences.
Efter at have mærket glycanen var forskerne i stand til at visualisere, hvor den er placeret i bakteriecellevæggen, og at studere, hvad der sker med det gennem de første par dage af tuberkuloseinfektion af værtsimmunceller.
Forskerne håber nu at bruge denne tilgang til at udvikle en diagnostik, der kan detektere TB-associerede glycaner, enten i kultur eller i en urinprøve, som kunne tilbyde et billigere og hurtigere alternativ til eksisterende diagnostik. Røntgenstråler i brystet og molekylær diagnostik er meget nøjagtige, men er ikke altid tilgængelige i udviklingslande, hvor TB-satserne er høje.
I disse lande diagnosticeres TB ofte ved dyrkning af mikrober fra en sputumprøve, men denne test har en høj falsk negativ hastighed, og det kan være vanskeligt for nogle patienter, især børn, at tilvejebringe en sputumprøve. Denne test kræver også mange uger for, at bakterierne vokser og forsinker diagnosen.
“Der er ikke mange gode diagnostiske muligheder, og der er nogle patientpopulationer, herunder børn, der har svært ved at give prøver, der kan analyseres. Der er en masse drivkraft til at udvikle meget enkle, hurtige test,” siger Laura Kiesssling, Novartis -professor i kemi ved MIT og seniorforfatteren til undersøgelsen.
MIT -kandidatstuderende Stephanie Smelyansky er hovedforfatter af papiret. Andre forfattere inkluderer Chi-Wang Ma, en MIT Postdoc; Victoria Marando, Ph.D.; Gregory Babunovic, en postdoc ved Harvard Th Chan School of Public Health; Så Young Lee, en MIT -kandidatstuderende; og Bryan Bryson, lektor i biologisk teknik ved MIT.
Mærkning af glycaner
Glykaner findes på overfladerne i de fleste celler, hvor de udfører kritiske funktioner, såsom formidling af kommunikation mellem celler. I bakterier hjælper glycaner mikroberne med at komme ind i værtsceller, og de ser også ud til at kommunikere med værtsimmunsystemet, i nogle tilfælde blokere immunresponsen.
“Mycobacterium tuberculosis har en virkelig detaljeret cellekonvolut sammenlignet med andre bakterier, og det er en rig struktur, der er sammensat af en masse forskellige glycaner,” siger Smelyansky.
“Noget, der ofte er undervurderet, er det faktum, at disse glycaner også kan interagere med vores værtsceller. Når vores immunceller genkender disse glycaner, i stedet for at sende et faresignal, kan det sende den modsatte besked, at der ikke er nogen fare.”
Glykaner er notorisk vanskelige at mærke med nogen form for sonde, fordi de i modsætning til proteiner eller DNA ikke har karakteristiske sekvenser eller kemiske reaktiviteter, der kan målrettes. Og i modsætning til proteiner er de ikke genetisk kodet, så celler ikke kan genetisk konstrueres til at producere sukker, der er mærket med fluorescerende tags, såsom grønt fluorescerende protein.
En af de vigtigste glycaner i M. tuberculosis, kendt som manlam, indeholder et sjældent sukker kendt som MTX, som er usædvanligt, idet det har en thioether – en svovl atom klemt mellem to carbonatomer. Denne kemiske gruppe gav en mulighed for at bruge et lille molekyle-tag, der tidligere var blevet udviklet til mærkning af methionin, en aminosyre, der indeholder en lignende gruppe.
Forskerne viste, at de kunne bruge dette mærke, kendt som en oxaziridin, til at mærke Manlam i M. tuberculosis. Forskerne forbandt oxaziridinet med en fluorescerende sonde og viste, at dette tag i M. tuberculosis dukkede op i det ydre lag af cellevæggen.
Da forskerne udsatte etiketten for Mycobacterium smegmatis, en beslægtet bakterie, der ikke forårsager sygdom og ikke har sukker MTX, så de intet fluorescerende signal.
“Dette er den første tilgang, der virkelig selektivt giver os mulighed for at visualisere en glycan især,” siger Smelyansky.
Bedre diagnostik
Forskerne viste også, at de efter mærkning af manlam i M. tuberculosis -celler kunne spore cellerne, da de inficerede immunceller kaldet makrofager.
Nogle forskere i tuberkulose havde antaget, at bakteriecellerne kaster manlam en gang inde i en værtscelle, og at de frie glycaner derefter interagerer med værtsimmunsystemet. MIT -teamet fandt imidlertid, at glycanen ser ud til at forblive i bakteriecellevæggene i mindst de første par infektionsdage.
“Bakterierne har stadig deres cellevægge fastgjort til dem. Så det kan være, at nogle glycan frigives, men størstedelen af det bevares på bakteriecelleoverfladen, som aldrig er blevet vist før,” siger Smelyansky.
Forskerne planlægger nu at bruge denne tilgang til at studere, hvad der sker med bakterierne efter behandling med forskellige antibiotika eller immunstimulering af makrofager. Det kan også bruges til at studere mere detaljeret, hvordan bakteriecellevæggen samles, og hvordan manlam hjælper bakterier med at komme ind i makrofager og andre celler.
“At have et greb om at følge bakterierne er virkelig værdifuldt, og det giver dig mulighed for at visualisere processer, både i celler og i dyremodeller, der tidligere var usynlige,” siger Kiessling.
Hun håber også at bruge denne tilgang til at skabe ny diagnostik til tuberkulose. Der er i øjeblikket en diagnostik i udviklingen, der bruger antistoffer til at detektere manlam i en urinprøve. Imidlertid fungerer denne test kun godt hos patienter med meget aktive tilfælde af TB, især mennesker, der er immunsupprimeret på grund af HIV eller andre tilstande.
Ved hjælp af deres lille molekylsensor i stedet for antistoffer håber MIT-teamet at udvikle en mere følsom test, der kan detektere manlam i urinen, selv når der kun er små mængder.